Ioana Silvia HOSU
Soutenance : 11 février 2020
IEMN Amphitheatre - Central Laboratory - Villeneuve d'Ascq
Jury :
- Yannick COFFINIER, Chargé de recherche, Université de Lille – IEMN, Directeur de thèse
- Celine ELIE-CAILLE, L’Institut FEMTO-ST, Rapporteur
- Yann CHEVOLOT, Directeur de Recherche, Institut des Nanotechnologies de Lyon, Rapporteur
- Rabah BOUKHERROUB, Directeur de Recherche, IEMN, Examinateur
- Claudia MURACCIOLE BICH, Maître de Conférences, IBMM, Université de Montpellier, Examinateur
- Tuami LASRI, Professeur des Universités, Université de Lille – Examinateur
Summary:
Les attaques bioterroristes sont devenues plus fréquentes ces dernières années et le large éventail d’agents bioterroristes en fait un problème important à résoudre. La ricine appartient à la famille des protéines inactivant les ribosomes (RIP). Les RIP sont des toxines biologiques, solubles dans l’eau, qui peuvent être facilement extraites de légumes (ricine de graines de ricin, abrin de pois rosay) ou de bactéries (toxine de Shiga). La ricine est composée de deux chaînes: la chaîne A de la ricine, une N-glycosidase induisant la toxicité par élimination de l’adénine (action dépurination) de l’ARNr 28S des sous-unités ribosomales 60S, puis en inhibant la synthèse protéique, et la chaîne B de la ricine, une lectine qui se lie des fragments de sucre spécifiques sur la membrane extracellulaire, assurant l’absorption de la toxine. Comme ils inhibent la synthèse des protéines, en fonction de la voie d’absorption (orale, par inhalation, par voie intraveineuse) et de la dose reçue, la mort peut survenir. En l’absence de contre-mesures efficaces, les méthodes de détection de ces toxines doivent être rapides, fiables, sélectives et sans aucune ambiguïté, en particulier les analyses de pré-assimilation. Les méthodes actuelles principalement basées sur SERS, ELISA, Colorimétrie et SPR ne répondent pas à toutes ces exigences.
Même si la spectrométrie de masse a été utilisée pour la détection de la ricine, elle ne peut pas être réalisée sans une longue et fastidieuse préparation d’échantillon, c’est-à-dire une digestion enzymatique, une extraction /purification et une identification de protéines sur la base d’une analyse peptidique suivie d’une comparaison avec la base de données existante. Dans ce travail, nous avons montré comment les matériaux à base de carbone (nanomurs de carbone) pourraient être appliqués comme matériaux nanostructurés pour la détection de la ricine par ionisation laser/désorption de surface pour la détection par spectrométrie de masse (SALDI-MS) et d’autres techniques. Tout d’abord, l’adéquation des nanoparticules de carbone en tant que bonne surface SALDI a été initialement étudiée pour des biomolécules plus petites (saccharides, peptides jusqu’à 5800 m / z, glucides, lipides et glucose, qui a également été quantifié à l’aide de SALDI-MS).
En ce qui concerne les protéines, elles sont difficiles à ioniser et à détecter avec SALD-MS, en raison de leur grand poids moléculaire. La capacité des CNWs à désorber et à ioniser les protéines a nécessité de nombreuses étapes d’optimisation (réalisée pour la détection de protéines en jouant avec la nature et la concentration de sel, le temps d’incubation, les caractéristiques physico-chimiques des nanomurs (comme la hauteur, le dopage au bore ou la morphologie). Pour ce faire, le cytochrome C a été utilisé comme protéine modèle, comme il était habituellement décrit précédemment dans SALDI-MS, étant facile à désorber. Enfin, des nanomurs de carbone alignées verticalement ont ensuite été modifiées à l’aide de sucres à lectine spécifiques (galactosamine), pour la détection directe de la chaîne B de la ricine dans des échantillons réels, tels que des boissons sans alcool et du sérum sanguin. Nous avons obtenu une limite de détection (80 ng/0.5 μL) trois fois inférieure à la dose létale médiane la plus faible (DL50 = 10 μg/kg). Cette détection peut être réalisée dans les 10 min.
Les surfaces multifonctionnelles sont décrites comme des perspectives pour des outils d’analyse bimodaux plus puissants, en combinant deux techniques, telles que: SPR (résonance plasmonique de surface)/SALDI-MS, SERS (Spectroscopie Raman Exaltée de Surface)/SALDI-MS et EC(Électrochimie)/SALDI-MS. Une attention particulière a été portée sur la SPR / SALDI-MS car elle permet d’obtenir des interactions quantitatives et moléculaires en temps réel (SPR) et une identification structurelle des analytes (MS). Différentes méthodes de dépôt de matériaux de type graphène ont été étudiées (méthode de surfactant à bulle d’oxyde de graphène, transfert par voie humide de graphène CVD, dépôt électrophorétique de graphène, couche par couche en utilisant un polycation et un oxyde de graphène, coulée en goutte à goutte de graphène et d’oxyde de graphène réduit) . Le cytochrome C (en tant que protéine modèle) a été détecté en utilisant les trois premières méthodes et seuls les peptides ont été détectés pour les deux dernières méthodes, l’ordre de mention étant en corrélation avec la diminution de l’efficacité de SALDI-MS vis-à-vis des protéines.
Comme ceci, cette thèse décrit le premier capteur direct à base de ricine SALDI-MS, capable de détecter une dose inférieure à la dose mortelle chez l’homme et d’apporter une contribution importante à la lutte contre d’éventuelles attaques terroristes. L’étude systématique de différents paramètres qui influencent ce processus LDI-MS est également présenté. Les surfaces doubles étudiées, en particulier les techniques bimodales SPR/MS, ont présenté une cohérence fiable pour les approches ultérieures permettant de créer des outils analytiques plus puissants.
Abstract:
Bio-terroristic attacks have become more frequent in the past years and the wide range of bio-terroristic agents makes this an important issue to overcome. Ricin is part of the ribosome-inactivating proteins (RIP). RIPs are vegetable toxins, water soluble, which can be easily extracted from plants (ricin from castor beams, abrin from rosary pea) or from bacteria (Shiga toxin). These proteins are composed of two chains: ricin A chain, a glycosidase that insures the toxicity by removal of adenine (depurination) from the RNAr 28S from the 60S ribosomal subunits, followed by the inhibition of protein synthesis, and ricin B chain, a lectin that binds to specific sugar moieties on the surface of the cells, assuring transportation the cell uptake. As they inhibit protein synthesis, depending of the administration take-up (oral, inhalation, intravenously) and the dose received, cell death also occurs. In the absence of efficient counter measurements, detection methods of these toxins have to be fast, reliable, selective and suitable, especially pre-assimilation analysis. The current methods (based on SERS, ELISA, Colorimetric, SPR and MS) do not overcome all these requirements.
Even though mass spectrometry was used for ricin detection, it cannot be performed without long and tedious sample preparation, meaning through enzymatic digestion, extraction/purification and identification of the proteins based on the peptide analysis, followed by comparison with an existent database (mass fingerprint). In this work, we describe how carbon-based materials (carbon nanowalls and others) can be used as nanostructured materials for specific ricin-like proteins sensors, using surface assisted laser/desorption ionization mass spectrometry (SALDI-MS) and other techniques. The suitability of the carbon nanowalls (CNWS) was proven initially for other smaller bio-molecules (saccharides, peptides up to 5800 m/z, carbohydrates, lipids and glucose, which was also quantified using SALDI-MS).
When it comes to proteins, they are hard to ionize and detect using SALD-MS, due in part to their big molecular weight. The ability of CNWs to desorb and ionize proteins required a lot of optimization steps of the SALDI-MS method (salt nature, concentration, and pH, incubation time, physicochemical characteristics of the nanowalls, such as height, boron doping and morphology). A systematic optimization was done using a model protein, the cytochrome C). From this, we were able, for the first time, to detect Ricin B chain without the use of organic matrix. To go further in improving Ricin detection performances, carbon nanowalls were then covalently modified using specific lectin sugars (galactosamine) and the ability to detect Ricin B chain in real samples such as soft drinks and blood serum was demonstrated within10 minutes. We obtained a limit of detection (80 ng/0.5 μL) that is 3 times lower than the lowest median lethal dose (LD50 = 10 μg/kg).
Multifunctional surfaces are described as perspectives for more powerful bimodal analytical tools, by combining two techniques, such as: SPR(Surface Plasmon Resonance)/SALDI-MS, SERS(Surface Enhanced Raman Spectroscopy)/SALDI-MS and EC(Electrochemistry)/SALDI-MS. Special attention was focused on SPR/SALDI-MS as it can achieve both quantitative and molecular interactions in real-time (SPR) and precise identification of the analytes (MS). Different depositions methods of graphene-like materials were studied to ensure a good surface coverage of the substrate : 1)bubble surfactant method of graphene oxide, 2) wet transfer of CVD pristine graphene, 3) electrophoretic deposition of graphene, 4) layer by layer using a polycation and graphene oxide, 5) drop casting of both graphene and reduced graphene oxide). Cytochrome C (as model protein) was detected using the first three methods and only peptides were detected for the last two methods, as the mentioning order is in correlation with decreasing SALDI-MS efficiency towards proteins.
In this thesis, we described the first world wide ricin-like proteins SALDI-MS sensor, which is able to detect below the lethal dose in humans and bring an important contribution to the fight against eventual terroristic attacks. The systematic study of different parameters that influence this LDI-MS process is also presented. The dual surfaces studied, in particular the SPR/MS bimodal techniques, presented reliable consistency for further approaches in creating more powerful analytical tools.