Nanopuces à ADN pour appréhender les cellules tumorales

Détecter des cellules cancéreuses métastatiques qui circulent dans les vaisseaux sanguins est une tâche très difficile. Il s’agit d’identifier un serial killer caché parmi des milliards d’individus, dilués dans quelques gouttes de sang. Les empreintes digitales du criminel sont certaines protéines qui se trouvent à la surface de la cellule tumorale circulante. Heureusement, des petites séquences d’ADN, les aptamères, sont capables de les reconnaitre de manière unique, même en minuscules quantités. Nous avons dessiné des nanopuces qui alignent des milliers de ces aptamères « policiers », qui peuvent se coller aux protéines tumorales dans une biopsie liquide et identifier la cellule killer parmi les millions de cellules normales, avec un signal électrique caractéristique.

L’une des principales causes de décès des patients atteints de cancer est la défaillance d’un organe induite par le développement de métastases. La tumeur primaire se propage dans l’organisme en générant des cellules tumorales circulantes (CTC), c’est-à-dire des cellules cancéreuses qui se détachent de la tumeur et circulent dans les vaisseaux sanguins. Notre institut, l’IEMN, est partenaire d’un effort de recherche international et multidisciplinaire visant à développer une famille originale et innovante de dispositifs de laboratoire sur puce, destinés à détecter les CTC avec une grande efficacité. Les dispositifs sont basés sur un effet mécanique quantique sophistiqué, qui permet de détecter la présence d’une cellule cancéreuse immobilisée sur la puce avec une extrême précision. En bref, un fragment d’ADN portant une molécule d’oxydoréduction à une extrémité est pris en sandwich entre deux électrodes ; à l’équilibre, l’ADN fluctue de manière aléatoire et la molécule d’oxydoréduction induit un courant très faible, via l’effet tunnel quantique des électrons de/vers l’électrode négative ; en présence d’une CTC, l’ADN est capable d’identifier la présence d’antigènes spécifiques du cancer présents à la surface des CTC, dont la présence est détectée par la variation du courant tunnel quantique. Les premiers résultats de cette technique ont été publiés récemment dans les revues Biosensors and Bioelectronics et ACS Sensors. Dans ce qui suit, nous donnons une description plus complète de la technique et de ses principaux résultats.

Le premier protagoniste de cette histoire est la molécule d’adhésion des cellules épithéliales (EpCAM). Cette protéine, présente sur la membrane externe des cellules épithéliales, a fait l’objet d’une grande attention en tant que principal marqueur membranaire utilisé pour isoler les CTC. La biologie de l’EpCAM et son rôle ne sont pas complètement compris, mais des preuves suggèrent que l’expression de cette protéine de surface des cellules épithéliales est cruciale pour les CTC métastatiques, étant donné que la plupart des cancers proviennent de cellules épithéliales. Un résultat typique du dépistage clinique est que les durées de survie sans progression et de survie globale du cancer sont considérablement réduites chez les patients présentant ≥5 CTC par échantillon de sang de 7,5 ml, ou ≥20 EV positifs à EpCAM. Considérez qu’un tel volume de sang contient environ 40 milliards de globules rouges et environ 50 millions d’autres cellules (leucocytes, granulocytes), et vous pouvez vous faire une idée du niveau de résolution requis pour capturer et discriminer une seule CTC de l’ensemble de la masse cellulaire normale.

Les autres personnages principaux de la pièce sont les aptamères d’ADN. Les aptamères sont de courts fragments d’ADN ou d’ARN (ADN ss ou ARN ss) synthétisés artificiellement qui peuvent se lier à une protéine cible spécifique, ainsi qu’à des peptides, des hydrates de carbone, de petites molécules, des toxines et même des cellules vivantes, avec une sélectivité extrême de l’ordre du nM (ce qui signifie qu’ils peuvent trouver sélectivement un élément cible sur un échantillon d’un milliard). Depuis leur découverte au début des années 1990, des efforts considérables ont été déployés pour les rendre cliniquement pertinents pour des maladies telles que le cancer, le VIH et la dégénérescence maculaire. Avec les progrès de la médecine de haute précision, de la thérapie ciblée, de l’imagerie et des nanotechnologies, les aptamères sont d’emblée considérés comme les meilleurs ligands de ciblage potentiels grâce à leur synthèse chimique peu coûteuse et à la facilité avec laquelle ils peuvent être modifiés pour s’adapter à des cibles variables.

Si les aptamères de l’ADN et les protéines EpCAM trouvées à la surface des CTC sont deux amants à marier, voici le révérend père qui conduit la cérémonie. Il s’agit d’une variante de la méthode électrochimique de voltampérométrie cyclique (CV), une technique expérimentale assez ancienne et standard que presque tout le monde peut faire fonctionner dans son garage. Dans sa configuration la plus basique, la CV détecte la présence de molécules susceptibles de transférer des électrons, c’est-à-dire des espèces redox qui peuvent être réduites ou oxydées ; en faisant varier périodiquement le potentiel de l’électrode négative, de manière à balayer les niveaux d’énergie de la molécule redox, des électrons peuvent être transférés à la molécule et inversement, ce qui génère un courant. La forme du tracé du potentiel en fonction du courant est très typique de chaque espèce moléculaire et décrit la barrière énergétique que les électrons doivent franchir pour passer d’un état stable à l’autre. Nous transformons ici la méthode CV générale en un outil de diagnostic microscopique extrêmement sophistiqué. Dans nos expériences, une molécule d’oxydoréduction est fixée à une extrémité d’un aptamère d’ADN court, qui est lui-même fixé à une électrode d’or par son autre extrémité. Dans une telle configuration, l’ADN se comporte comme un filin qui fait fluctuer de manière aléatoire la position de la molécule d’oxydoréduction au-dessus de la surface de l’électrode, entre une distance d’approche minimale et une distance d’élongation maximale. Lorsque la molécule fluctue à proximité de la surface, l’électron peut passer la barrière par effet tunnel quantique et donner lieu à un courant faible, mais mesurable ; mais lorsque la molécule fluctue loin de la surface, le courant devient nul. Il s’agit là du principe de fonctionnement essentiel de notre méthode innovante de détection des CTC : étant donné que la séquence de l’aptamère ADN est conçue pour reconnaître sélectivement la protéine EpCAM, lorsqu’une cellule CTC est présente “au-dessus” de l’électrode dans la solution, l’aptamère ADN s’y colle, bloquant ainsi l’espèce redox à une position située bien au-dessus de la surface de l’électrode, et coupant efficacement le signal de courant.

Le dispositif actuel est un laboratoire microfluidique sur puce, d’une taille de quelques mm2 (voir la figure). La surface de l’électrode Au est décorée d’un réseau régulier de nanopilliers en plastique (silsesquiloxane d’hydrogène réticulé), d’une hauteur de 20 nm et d’une largeur de 200 nm, espacés de 500 nm. L’aptamère d’ADN fixé à la surface d’Au a une longueur étendue d’environ 15 nm, mais à température ambiante, il adopte une conformation partiellement repliée, ce qui le réduit à une structure plus compacte d’environ 10 nm ; une molécule de ferrocène (espèce redox) est fixée à l’extrémité libre de l’ADN. Les aptamères d’ADN porteurs de ferrocène sont déposés sous forme de monocouche dense sur la surface d’Au. L’ensemble du dispositif est intégré dans une puce microfluidique, dans laquelle une solution contenant différents types de cellules cibles est transportée à faible vitesse. Dans les premières expériences, les cellules CAPAN-2 du cancer du pancréas et les cellules RAMOS du lymphome de Burkitt ont été utilisées comme test. Les cellules en mouvement sont piégées sur les nanopiliers et restent suspendues, tombant lentement vers la surface par gravité. Les protéines membranaires de surface, dont la cible EpCAM, peuvent ainsi s’approcher de l’attache fluctuante de l’ADN. Une fois que chaque ADN est attaché à une EpCAM, cela contribue à une réduction du courant total mesuré, de l’ordre du microampère. La limite inférieure de résolution actuelle est d’environ 3 000 cellules par ml, ce qui est encore élevé par rapport à l’objectif fixé. Cependant, cette première version du dispositif technique présente une grande marge d’amélioration et est très prometteuse en raison de sa polyvalence (les protéines cibles peuvent être facilement modifiées en changeant la séquence de l’aptamère ADN, différentes protéines peuvent être ciblées simultanément en utilisant plusieurs aptamères en parallèle), et aussi en raison de son coût de fabrication très réduit par rapport aux technologies courantes actuelles.

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssensors.3c00570

L’équipe est composée d’un groupe multidisciplinaire de physiciens, de chimistes, d’ingénieurs et de biologistes, provenant du laboratoire LIMMS à Tokyo (Japon), de l’IEMN et de l’unité de recherche sur le cancer CANTHER, tous deux à Lille (France). La contribution de l’équipe de l’IEMN se concentre sur la chimie de surface de l’électrode et l’immobilisation de l’ADN, dirigée par le Dr Yannick Coffinier, et sur la simulation informatique des interactions ADN-protéines en solution, dirigée par le Prof. Fabrizio Cleri .