Thèse de ÉLise DELANNOY

« Modèles de vaisseaux sanguins sur puce pour l’étude des fonctions de la barrière endothéliale »

Soutenance le 13 décembre 2021 à 14 h
Amphithéâtre de l’IEMN – Laboratoire central – Villeneuve d’Ascq

Jury :

Julie GAVARD, Directeur de recherche CNRS, Université de Nantes, Rapportrice
Séverine LE GAC, Associate professor, Twente University (Pays-bas), Rapportrice
Vincent THOMY, Professeur des universités, Université de Lille, Examinateur
Maria Carla PARRINI, Ingénieure de recherche INSERM, Institut Curie, Examinatrice
Anne Marie GUE, Directrice de recherche CNRS, LAAS, Examinatrice
Fabrice SONCIN, Directeur de recherche INSERM, Directeur de thèse
Dominique COLLARD, Directeur de recherche CNRS, Co-Directeur de thèse
Anthony TREIZEBRE, Maître de conférences, Université de Lille, Encadrant

Résumé :

Le système vasculaire sanguin est un réseau de conduits qui transporte le sang à travers l’organisme. Par leurs fonctions de transport du sang, les vaisseaux sanguins jouent des rôles importants dans l’apport en oxygène et en nutriments aux tissus et l’évacuation des déchets métaboliques. Ainsi, les vaisseaux sanguins forment une barrière plus ou moins perméable qui permet ces échanges et qui régule également la réponse immunitaire. Le microenvironnement joue également un rôle important dans la fonctionnalité des vaisseaux. La composition et les propriétés physiques de la matrice extracellulaire et les cellules périvasculaires orientent fortement la physiologie des cellules endothéliales et influencent la barrière vasculaire. Dans le cadre de l’inflammation, l’hyperperméabilité vasculaire est un problème de santé publique et constitue un effet secondaire bien connu de certains traitements, notamment anti-cancéreux.
Pour étudier ces phénomènes vasculaires, nous proposons des nouveaux modèles combinant la microfabrication, l’ingénierie tissulaire et les technologies microfluidiques permettant de construire des organes sur puce. Les organes sur puce sont un tournant technologique permettant de répondre à des questions biologiques complexes. Ils visent à combler le fossé entre des tests 2D in vitro trop peu représentatifs de l’in vivo et des modèles animaux coûteux, chronophages et spécifiques aux espèces. Nous avons conçu des dispositifs de vaisseaux sur puce dans lesquels un canal initial a été créé dans un hydrogel à base de collagène en utilisant des approches microfluidiques qui reposent soit sur les propriétés d’écoulement laminaires, la focalisation en flux, soit sur les propriétés viscoélastiques des solutions en microcanaux, la digitation visqueuse. Cette dernière technique a particulièrement été développée et a permis de former un canal initial qui constitue la future lumière du vaisseau qui a été ensemencé avec des cellules endothéliales primaires humaines. Celles-ci ont formé une monocouche confluente et cohésive, de manière à reproduire la face interne d’un vaisseau sanguin.
Cette technique a été réalisée une seule ou deux fois de suite et a ainsi permis de varier, selon le canal utilisé, le diamètre du vaisseau final et aussi de créer une double couche cellulaire. L’intégrité de la barrière endothéliale a été étudiée par l’évaluation de la qualité de la répartition de la vascular endothelial-cadherin au niveau des jonctions adhérentes et de zona-occludens-1 pour les jonctions serrées. D’autre part, la perméabilité de l’endothélium a été étudiée par la mise en place d’une approche de vidéomicroscopie pour quantifier la diffusion en temps réel de dextran-fluorescent à travers l’endothélium des vaisseaux. La capacité d’activation des cellules endothéliales par des cytokines pro-inflammatoires et leur capacité à induire l’adhérence de cellules immunitaires et de cellules cancéreuses à la face interne de la lumière des vaisseaux ont été également évaluées.
L’approche biomimétique de ce modèle a été enrichie en formant deux couches cellulaires distinctes et concentriques constituées de cellules endothéliales et de fibroblastes périvasculaires afin d’approcher encore plus fidèlement la structure et la composition d’un vaisseau sanguin naturel et d’observer l’influence des interactions entre les deux types cellulaires sur la perméabilité des vaisseaux. Ainsi, la présence de fibroblastes périvasculaires a significativement renforcé la barrière endothéliale, notamment en réponse à la thrombine. Enfin, ces vaisseaux-sur-puce ont été conçus dans un format standardisé de plaque multi-puits dans le but d’être utilisés pour le criblage robotisé et à haut débit de médicaments.Nous proposons ici des dispositifs adaptés au criblage de molécules effectrices de l’activation et de la perméabilité vasculaire, notamment dans le cadre des traitements anti-cancéreux.

Abstract:

The blood vascular system is a network of conduits that transports blood throughout the body. Through their blood transport functions, blood vessels play important roles in the supply of oxygen and nutrients to tissues and the evacuation of metabolic waste. Thus, blood vessels form a more or less permeable barrier that allows these exchanges and also regulates the immune response. The microenvironment also plays an important role in vessel functionality. The composition and physical properties of the extracellular matrix and the perivascular cells strongly influence the physiology of the endothelial cells and the vascular barrier. In the context of inflammation, vascular hyperpermeability is a public health problem and a well known side effect of certain treatments, notably anti-cancer.
To study these vascular phenomena, we propose new models combining microfabrication, tissue engineering and microfluidic technologies to build organs on a chip. Organs-on-a-chip are a technological milestone to answer complex biological questions. They aim to bridge the gap between 2D in vitro tests that are not representative enough of in vivo and expensive, time-consuming and species-specific animal models. We have designed vessel-on-chip devices in which an initial channel has been created in a collagen-based hydrogel using microfluidic approaches that rely either on laminar flow properties, flow focusing, or on the viscoelastic properties of solutions in microchannels, viscous digestion. The latter technique was particularly developed and allowed to form an initial channel that constitutes the future lumen of the vessel that was seeded with primary human endothelial cells. These cells formed a confluent and cohesive monolayer, so as to reproduce the inner surface of a blood vessel.

This technique was performed once or twice in a row and thus allowed to vary, depending on the channel used, the diameter of the final vessel and also to create a double cell layer. The integrity of the endothelial barrier was studied by evaluating the quality of the distribution of vascular endothelial-cadherin at adherens junctions and zona-occludens-1 for tight junctions. On the other hand, the permeability of the endothelium was studied by implementing a videomicroscopy approach to quantify the real-time diffusion of dextran-fluorescent through the vessel endothelium. The ability of endothelial cells to be activated by pro-inflammatory cytokines and their ability to induce adhesion of immune cells and cancer cells to the inner face of the vessel lumen were also evaluated.
The biomimetic approach of this model was enriched by forming two distinct and concentric cell layers consisting of endothelial cells and perivascular fibroblasts in order to more closely approximate the structure and composition of a natural blood vessel and to observe the influence of interactions between the two cell types on vessel permeability. Thus, the presence of perivascular fibroblasts significantly strengthened the endothelial barrier, especially in response to thrombin. Finally, these vessels-on-a-chip were designed in a standardized multi-well plate format with the aim of being used for robotic and high-throughput drug screening.We propose here devices adapted to the screening of effector molecules of vascular activation and permeability, notably in the context of anti-cancer treatments.