Résumé :

Les vaisseaux sanguins sont centraux pour le traitement de nombreux cancers. D’une part, ils forment un obstacle au passage efficace des thérapies de la circulation sanguine vers les tumeurs solides. D’autre part, ils sont également à l’origine de la formation de nouveaux vaisseaux via l’angiogenèse, un processus qui favorise le développement des tumeurs et qui est la cible de plusieurs thérapies anticancéreuses actuellement utilisées en clinique. Le microenvironnement tumoral joue un rôle essentiel dans la morphologie des vaisseaux. En particulier, la composition et les propriétés physiques de la matrice extracellulaire et les cellules périvasculaires orientent fortement la physiologie des cellules endothéliales et influencent la perméabilité de la barrière vasculaire. Dans le cadre de l’inflammation, l’hyperperméabilité vasculaire est un problème de santé publique et constitue un effet secondaire bien connu de certains traitements anti-cancéreux. Pour étudier ces phénomènes vasculaires, nous proposons un nouveau modèle combinant la microfabrication, l’ingénierie tissulaire et les technologies microfluidiques. Ces techniques allient les approches de culture cellulaire en 3D et de perfusion, permettant de construire des organes-sur-puce. Nous avons conçu des dispositifs de vaisseaux-sur-puce dans lesquels un canal initial est créé dans un hydrogel à base de collagène en utilisant une approche microfluidique qui repose sur les propriétés de viscosité du collagène. Ce canal initial, qui constitue la future lumière du vaisseau, est ensuite ensemencé avec des cellules endothéliales primaires humaines qui forment alors une monocouche confluente et cohésive, de manière à reproduire la face interne d’un vaisseau sanguin. Cette technique peut être réalisée une seule ou deux fois et permet ainsi de varier, à façon, le diamètre du vaisseau final et aussi de créer une double couche cellulaire. L’intégrité de la barrière endothéliale a été étudiée par l’évaluation de la qualité de la répartition de la vascular endothelial-cadherin au niveau des jonctions adhérentes et de zona-occludens-1 pour les jonctions serrées. D’autre part, la perméabilité de l’endothélium a été étudiée par la mise en place d’une approche de vidéomicroscopie pour quantifier la diffusion en temps réel d’un dextran-fluorescent à travers l’endothélium des vaisseaux. La capacité d’activation des cellules endothéliales par des cytokines pro-inflammatoires et leur capacité à induire l’adhérence de cellules immunitaires et de cellules cancéreuses à la face interne de la lumière des vaisseaux ont été évaluées. L’approche biomimétique de ce modèle a été enrichie en formant deux couches cellulaires distinctes et concentriques constituées de cellules endothéliales et de fibroblastes périvasculaires afin d’approcher encore plus fidèlement la structure et la composition d’un vaisseau sanguin naturel et d’observer l’influence des interactions entre les deux types cellulaires sur la perméabilité des vaisseaux. Ainsi, la présence de fibroblastes périvasculaires renforce significativement la barrière endothéliale, notamment en réponse à la thrombine. Ces vaisseaux-sur-puce sont conçus dans un format standardisé de plaque multi-puits dans le but d’être utilisés pour le criblage robotisé et à haut débit de médicaments. Les dispositifs microfluidiques sont un tournant technologique pour répondre à des questions biologiques complexes. Ils visent à combler le fossé entre des tests 2D in vitro trop simples et des modèles animaux coûteux, chronophages et spécifiques aux espèces. Nous proposons ici un dispositif adapté au criblage de molécules effectrices de l’activation et de la perméabilité vasculaire, notamment dans le cadre des traitements anti-cancéreux.

Abstract :

Blood vessels are central to the treatment of many cancers. On the one hand, they form a barrier to the efficient passage of therapies from the bloodstream to solid tumors. On the other hand, they are also responsible for the formation of new vessels via angiogenesis, a process that promotes tumor development and is the target of several anti-cancer therapies currently used in the clinic. The tumor microenvironment plays an essential role in vessel morphology. In particular, the composition and physical properties of the extracellular matrix and perivascular cells strongly direct the physiology of endothelial cells and influence the permeability of the vascular barrier. In the context of inflammation, vascular hyperpermeability is a public health concern and a well-known side effect of some anti-cancer treatments. To study these vascular phenomena, we propose a new model combining microfabrication, tissue engineering and microfluidic technologies. These techniques combine 3D cell culture and perfusion approaches, allowing the construction of organs-on-a-chip. We have designed vessel-on-chip devices in which an initial channel is created in a collagen-based hydrogel using a microfluidic approach that relies on the viscosity properties of collagen. This initial channel, which constitutes the future lumen of the vessel, is then seeded with primary human endothelial cells which then form a confluent and cohesive monolayer, so as to mimic the inner surface of a blood vessel. This technique can be performed once or twice and allows the diameter of the final vessel to be varied as desired and also to create a double cell layer. The integrity of the endothelial barrier was studied by evaluating the quality of the distribution of vascular endothelial-cadherin at adherens junctions and zona-occludens-1 for tight junctions. On the other hand, the permeability of the endothelium was studied by implementing a videomicroscopy approach to quantify the real-time diffusion of a dextran-fluorescent across the vessel endothelium. The ability of endothelial cells to be activated by pro-inflammatory cytokines and their ability to induce adhesion of immune cells and cancer cells to the inner face of the vessel lumen were evaluated. The biomimetic approach of this model was enriched by forming two distinct and concentric cell layers consisting of endothelial cells and perivascular fibroblasts in order to more closely approximate the structure and composition of a natural blood vessel and to observe the influence of interactions between the two cell types on vessel permeability. Thus, the presence of perivascular fibroblasts significantly reinforces the endothelial barrier, particularly in response to thrombin. These vessels-on-a-chip are designed in a standardized multi-well plate format with the aim of being used for robotic and high-throughput drug screening. Microfluidic devices are a technological turning point for answering complex biological questions. They aim at bridging the gap between too simple 2D in vitro assays and expensive, time-consuming and species-specific animal models. We propose here a device adapted to the screening of effector molecules of vascular activation and permeability, especially in the context of anti-cancer treatments.